روش شیمیایی اندازه گیری هموگلوبین در خون با روش سیان مت هموگلوبین، روش دستی اندازه گیری مرجع هموگلوبین است که برای کالیبراسیون دستگاه های شمارنده نیز کاربرد دارد. نکته های مهمی که هنگام انجام این آزمایش برای دستیابی به نتایج صحیح باید در نظر گرفته شوند:

• از ظرف های شیشه ای استفاده شود که ازنظر صحت در حد استاندارد (کلاس A) و ازلحاظ شیمیایی تمیز باشند.
• از دقت و صحت عملکرد سمپلرها، اسپکتروفتومتر و یا فتومتر با استفاده از برنامه های کنترل کیفیت اطمینان حاصل شود (تمام مستندات کنترل کیفیت ثبت شود.)
• در صورت امکان، از درابکین با ترکیب توصیه شدة  CLSI( مؤسسه استاندارد آزمایشگاه بالینی)، که مقادیر لازم برای تهیه آن در زیر آمده است، استفاده شود.
• KCN        0.05g
• K3Fe (CN)           0.2g
• KH2PO4 (Anhydrous)         0.140g
• Nonionic Detergent            0.5-1ml
• Clinical laboratory Reagent water(type I)           1000ml

این معرف در مدت 5 دقیقه تمام هموگلوبین ها را غیر از سولفوهموگلوبین به سیان مت هموگلوبین تبدیل می کند. کربوکسی هموگلوبین که در افراد سیگاری افزایش می یابد برای اکسید شدن به 30 دقیقه زمان نیاز دارد.

• محلول درابکین را باید در ظرفهای تیرة دربسته از جنس بوروسیلیکات نگهداری نمود و در صورت مشاهده کدری دور ریخت.
• هنگام استفاده از این محلول ها و دفع آنها، به علت سمی بودن، احتیاط های لازم باید ازنظر ایمنی به کار رود.
• از درابکین با ترکیب های دیگر ) غیر از فرمول بالا( نیز میتوان استفاده نمود، ولی زمان کامل شدن واکنش طولانی تر و احتمال ایجاد کدری بیشتر است.
• برای انجام آزمایش میتوان از نمونه خون مویرگی یا وریدی استفاده نمود، ولی استفاده از خون وریدی برتری دارد.
• ضد انعقاد مناسب، نمکهای EDTA (دی سدیک یا دی پتاسیک) هستند که به مقدار mg/ml 1.5-2.2 به ازای هر میلی لیتر خون باید استفاده شوند.
• پس از خونگیری، باید نمونه را بلافاصله با ضد انعقاد مخلوط نمود.
• در صورت استفاده از k3EDTA ،به دلیل ایجاد رقت در نمونه، میزان هموگلوبین تا 1 %کاهش نشان می دهد.

روش آزمایش

درروش معمول اندازه گیری هموگلوبین به روش دستی ml 0.02 خون با ml 5 درابکین مخلوط و پس از طی مدت لازم برای کامل شدن واکنش، جذب نوری آن با فتومتر خوانده می شود.

برای انجام آزمایش به منظور کالیبراسیون دستگاه شمارنده، از روش رقت زیاد استفاده می شود تا احتمال خطای ناشی از رقیق سازی کاهش یابد .برای اجرای این کار، می توان از روشهای رقیق سازی زیر استفاده کرد:

– ml 0.04 خون با ml 10 درابکین یا

– ml 0.4 خون با ml 100 درابکین یا

0.1 ml  خون با  25  ml درابکین

نکته:

در هر دو روش معمولی و با رقت زیاد، ابتدا نمونه خون توسط پیپت یا سمپلر با سرعت آهسته و ثابت کشیده میشود و پس از پاك کردن سطح خارجی پیپت یا سرسمپلر با پارچه بدون پرز، که با آب مقطر یا نرمال سالین مرطوب شده، داخل لوله آزمایش تخلیه میشود .نمونه باقیمانده در پیپت یا سرسمپلر، باید با 8 تا 10 بار برداشت و تخلیه، با محتویات لوله کاملاً شسته شود .برای مخلوط شدن کامل خون و درابکین، پس از 5 تا 6 بار سروته نمودن لوله، باید محلول را برای کامل شدن واکنش پیش از خواندن جذب نوری، 5 دقیقه در دمای اتاق نگهداری نمود.

برای انجام آزمايش، به ويژه به منظور بررسی کالیبراسیون دستگاه شمارنده، استفاده از وسايل شیشه ای کلاس A و ابزار و تجهیزات کالیبره ضروری است.

به منظور خواندن جذب نوری از فتومتر یا اسپکتروفتومتر با طول موج nm 540 استفاده می شود. در صورت استفاده از استاندارد هموگلوبین، جذب نوری این محلول نیز در طول موج ذکرشده خوانده شده و مقدار هموگلوبین برحسب گرم در لیتر از فرمول زیر محاسبه می شود:

برای رسم منحنی استاندارد هموگلوبین، ابتدا از محلول استاندارد، رقت های مختلف 1.2،1.3،1.4 تهیه و جذب نوری آنها در طول موج 540 nm  مقابل بلانک (درابکین )خوانده می شود. پس از تعیین مقدار هموگلوبین هر رقت، روی کاغذ نمودار خطی مقادیر جذب نوری هر رقت روی محور عرضی(Y)و مقدار غلظت هموگلوبین هر رقت روی محور طول (x) ثبت می شود. خطی که از مبدأ و نقاط تلاقی مقدار هموگلوبین و جذب نوری مربوط می گذرد، منحنی استاندارد نام دارد که میتوان با استفاده از آن غلظت هموگلوبین نمونه ها را محاسبه کرد.

منابع خطا

• تکنیک نامناسب خونگیری وریدی که با تغلیظ نمونه سبب افزایش کاذب مقدار هموگلوبین و شمارش سلولی می شود؛
• استفاده از تجهیزات بدون سوابق کنترل کیفیت و کالیبراسیون؛
• آگاهی ناکافی کارکنان از نحوة صحیح انجام آزمایش و منابع خطا؛
• مخلوط نمودن ناکافی نمونه پیش از آزمایش؛
• وجود لخته در نمونه؛
• نگهداری درابکین در مقابل نور یا یخ زدن؛
• استفاده از استاندارد خراب یا تاریخ مصرف گذشته (به ویژه اگر پس از باز شدن مدت طولانی در دمای اتاق بماند)؛
• کالیبراسیون نادرست اسپکتروفتومتر؛
• عملکرد نامناسب اسپکتروفتومتر ناشی از کافی نبودن زمان گرم شدن دستگاه یا بیش ازحد گرم شدن دستگاه، اختلالات مربوط به منبع نوری، فتوسل، ولتاژ، خطی نبودن دستگاه، صحیح قرارنگرفتن کووت و یا استفاده از کووت کثیف یا خش دار.